Isabel de Castilla, hija de Juan II de Castilla y de su segunda mujer, Isabel de Portugal (1428-1496), nació en Madrigal de las Altas Torres (Ávila) el 22 de abril, Jueves Santo, de 1451 en el palacio que hoy ocupa del Monasterio de Nuestra Señora de Gracia. El lugar y la fecha de nacimiento han sido históricamente discutidos, ya que cuando nace, nadie es consciente de la importancia que esa niña iba a tener en el futuro. Madrigal era entonces una pequeña villa de realengo donde circunstancialmente residía su madre, Isabel de Aviz, y de ella recibe el nombre que entonces no era frecuente en España.
Dos años después, en Tordesillas, nació su hermano Alfonso. Con anterioridad, y fruto del matrimonio entre Juan II de Castilla y María de Aragón, había nacido Enrique, hermano de padre de Isabel, que ocuparía el trono en 1454 y sería conocido como Enrique IV el Impotente.
A la muerte de su padre en 1454, se retiró con su madre y su hermano Alfonso a la villa de Arévalo, donde vería los ataques de locura de su madre Isabel. Esta es una época de dificultades, incluso económicas, pues aunque su padre había dejado importantes disposiciones testamentarias en favor de su madre, de ella, el rey Enrique IV las incumple reiteradamente. En esta adversidad Isabel se fortaleció con lecturas evangélicas y libros de piedad. También le ayudó su amistad con Santa Beatriz de Silva (1424 - 1491), a la que luego ayudaría en la fundación de la Orden de las Concepcionistas Franciscanas y a la que donó los palacios de Galiana. Otros personajes importantes en este momento y en general en su vida fueron Gutierre de Cárdenas, su esposa Teresa Enríquez y Gonzalo Chacon.
En 1461, Isabel y su hermano Alfonso son trasladados a Segovia, lugar donde se emplazaba la Corte, por estar cercano el nacimiento de la hija de los reyes, doña Juana de Castilla. Pronto se la apodó Juana la Beltraneja, pues, según los rumores de la época, era hija de la reina, doña Juana de Portugal, y de Beltrán de la Cueva.
Los nobles, ansiosos de poder, enfrentaron a su hermano Alfonso, de solo 12 años, con su hermanastro el rey Enrique, deponiéndolo en la "Farsa de Ávila". En 1468, su hermano Alfonso murió, posiblemente envenenado, en Cardeñosa. En un principio, se pensó que fue víctima de la peste, pero el médico que examinó el cadáver no encontró indicios de tal enfermedad.
A pesar de las presiones de los nobles, Isabel rechazó proclamarse reina mientras Enrique IV estuviera vivo. Por el contrario, consiguió que su hermanastro le otorgase el título de Princesa de Asturias, en una discutida ceremonia que tuvo lugar en los Toros de Guisando, el 19 de septiembre de 1468, conocida como la Concordia de Guisando. Se dice que don Andrés de Cabrera, tesorero real, dijo al rey: "La virtud y la modestia de la infanta nos obligan a esperar que no tendrá más voluntad que la vuestra, ni alentará la ambición de los Grandes, pues no hubiese rehusado el título de Reina que la ofrecían contentándose con el de Princesa que, a su entender, le pertenece." Isabel se constituyó así como heredera a la corona, por delante de Juana, su sobrina y ahijada de bautismo, a quien la nobleza no consideraba legitimada para ocupar el trono, por las dudas que había sobre su paternidad. A partir de este momento, Isabel pasa a residir en Ocaña, villa perteneciente a don Juan Pacheco, marqués de Villena. El rey inicia contactos diplomáticos con otras casas reales para lograr un acuerdo matrimonial que le reporte beneficios.
Ya desde los tres años, Isabel había estado comprometida con Fernando, hijo de Juan II de Aragón.
Más tarde, cuando contaba 16 años, Isabel fue comprometida con don Pedro Girón, Maestre de Calatrava y hermano de don Juan Pacheco. Se dice que Isabel rogó al cielo para que no llegaran a celebrarse los esponsales con este varón de 43 años. Don Pedro murió de un ataque de apendicitis, mientras realizaba el trayecto para encontrarse con su prometida.
En 1468 Enrique IV convino de nuevo el enlace entre Isabel y el rey Alfonso V de Portugal, ya que en el Tratado de los Toros de Guisando se había acordado que el matrimonio de Isabel debía celebrarse con la aprobación del monarca castellano. Ante la negativa de Isabel, el rey trató de que se desposara con el duque de Guyena, hermano de Luis XI de Francia; de nuevo Isabel se negó.
Mientras tanto, Juan II de Aragón, trató de negociar la boda con su hijo Fernando en secreto con Isabel. Isabel y sus consejeros consideraron que era el mejor candidato para esposo, pero había un impedimento legal, ya que eran primos (sus abuelos, Fernando de Antequera y Enrique III, eran hermanos). Necesitaban, por tanto, una bula papal que les exonerara de la consanguinidad. Tras muchas discrepancias y disputas se casan llamándose así los Reyes Católicos de las Españas.
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, y la medida de la hipotenusa es 
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